Петренко А.А. Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки - файл n1.doc

приобрести
Петренко А.А. Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки
скачать (3180.2 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc3181kb.10.06.2012 21:38скачать

n1.doc

  1   2   3   4   5   6


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГУ РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

им. Н.Н. БЛОХИНА

На правах рукописи
ПЕТРЕНКО АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки
(Онкология - 14.00.14)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: профессор, д.б.н. Ф.Л. Киселев

Москва 2003

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК 9

Распространение метилирования ДНК 9

Функция метилирования ДНК 12

Метилирование во время развития 13

Ферменты метилирования 15

Метилирование как динамический процесс 17

Роль метилирования в канцерогенезе 20

Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе 22

Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе 23

Сравнительный анализ современных методов определения статуса

метилирования ДНК 33

Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов 33

Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в

опухолях 35

Заключение 37

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38

  1. Список использованных реактивов 38

  2. Клинические материалы 40

  3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур 41

  4. Выделение ДНК из лейкоцитов 41

  5. Рестрикция геномной ДНК 42

  6. Бисульфитная модификация ДНК 43

  7. Полимеразная цепная реакция 43




  1. Праймеры 43

  2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 45

7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими

праймерами 46

7.4. Метилспецифическая ПЦР 46

8. Выделение продуктов ПЦР из гелей 47

  1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля 47

  2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 47


9. Клонирование продуктов ПЦР 47

  1. Вектор 47

  2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 48

  3. Трансформация клеток Escherichia coli 49

  4. Выделение плазмидной ДНК 49

10. Гель-электрофорез 50

  1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 50

  2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле 51

  3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле 52

11. Блот-гибридизация 53

  1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану 53

  2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану 53

  3. Получение меченого зонда 54

  4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране 54




  1. Обратная транскрипция 55

  2. Переосаждение ДНК (РНК) 55

  3. Анализ нуклеотидных последовательностей 55




  1. Поиск гомологий в банках данных 55

  2. Критерии CpG-островков 56

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57

1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки 57

  1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 57

  2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 63

  3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке шейки матки 70

  4. Определение полного размера CpG-островка гена вЗА-адаптина 72

2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена ЗА-адаптина
при раке шейки матки 76

  1. Исследование экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 76

  2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина в

опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 78

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 86

ВЫВОДЫ 94

ЛИТЕРАТУРА 95

- 5 -

Список сокращений

MOPS - морфолинпропансульфокислота ДМСО - диметилсульфоксид TEMED - N, N, N', N'- тетраметилэтилендиамин ПСА - персульфат аммония SDS - додецилсульфат натрия IPTG - изопропилтио-|3^-галактозид X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-галактозид ЭДТА - этилендиаминтетраацет натрия ГТЦ - гуанидинтиоционат ПААГ - полиакриламидный гель

СП-ПЦР - метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами

МЧР - метилчувствительная рестриктаза

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами ОТ-ПЦР - обратная транскрипция в сочетании с ПЦР н. п. - нуклеотидных пар

- 6 -Введение

Актуальность темы: Рак шейки матки занимает второе место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки (РШМ) признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы высокого риска (типы 16, 18 и другие). После вирусной инфекции РШМ может развиться через стадии дисплазии, рака in situ на протяжении нескольких лет, в течение которых в прогрессию опухоли вносят вклад возникающие и накапливающиеся изменения в клеточных генах, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности.

В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация и реарранжировка генов), но и в результате эпигенетических изменений, в том числе локального гиперметилирования ДНК. Аберрантному метилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках большинство CpG-островков не метилировано, а их метилирование в опухолевых клетках, как правило, сопровождается подавлением транскрипции соответствующего гена, наследуемой при делении клетки. Механизмы инициации локального метилирования CpG-островков в опухолях пока не ясны.

В последнее время разработаны методы идентификации гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках. Во многих случаях с помощью этих методов были идентифицированы гены, инактивируемые в опухолях путем аберрантного метилирования ассоциированных с ними CpG-островков. Среди них обнаружены как новые гены, утрата функций которых оказалась существенной для развития опухолей, так и известные гены, подавление экспрессии которых в опухолях в отсутствии инактивирующих мутаций уже было продемонстрировано. Число генов, для которых обнаружен альтернативный мутациям эпигенетический механизм инактивации в опухолях, постоянно растет, что свидетельствует о широком распространении этого механизма в процессе канцерогенеза.

Цель настоящей работы: Идентификация гиперметилированных в опухолях шейки матки CpG-островков и ассоциированных с ними генов, экспрессия которых может быть подавлена вследствие нарушения метилирования ДНК.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

  1. Провести скрининг аберрантно-метилированных GC-богатых последовательностей ДНК в карциномах шейки матки методом метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, определить нуклеотидную последовательность обнаруженных GC-богатых фрагментов ДНК, выявить среди них CpG-островки.

  2. Провести поиск в базах данных гомологий выявленных CpG-островков с известными последовательностями ДНК.

  3. В случае отсутствия гомологий CpG-островка с известными последовательностями в базах данных, провести клонирование и определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, фланкирующих CpG-островок для его локализации в геноме человека.

  4. В случае установления ассоциации выявленных CpG-островков с генами, провести анализ статуса метилирования и экспрессии соответствующих генов в первичных опухолях и клеточных линиях карцином шейки матки.

Научная новизна и практическая ценность работы:

С помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами было выявлено 7 GC-богатых фрагментов ДНК длиной от 300 до 1200 пар оснований, пять из которых (более двух третей) обладают свойствами CpG-островков. Из пяти выявленных CpG-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: фрагмент 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая 5' конец гена /ЗА-адаптина), фрагмент 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах данных.

В работе впервые показано подавление экспрессии мРНК гена /ЗА-адаптина в клеточных линиях рака шейки матки. Продукт гена /ЗА-адаптина представляет собой одну из субъединиц адаптерного комплекса АР-3, вовлеченного во внутриклеточный транспорт белков. Показана возможность восстановления экспрессии мРНК /ЗА-адаптина под действием деметилирующего агента 5-азацитидина, что указывает на связь процессов метилирования и транскрипции гена. Впервые определена нуклеотидная последовательность района, прилегающего к 5' концу гена. Установлены размер первого экзона гена /ЗА-адаптина и размер CpG-островка, ассоциированного с геном. CpG-островок гена /ЗА-адаптина включает 5' нетранскрибируемый район гена, первый экзон и начало первого интрона.

Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об участии клеточных генов в механизме злокачественной трансформации под действием вирусов папиллом человека. Обнаруженное подавление экспрессии гена /ЗА-адаптина в клетках карцином шейки матки указывает на необходимость дальнейшего исследования роли белковых комплексов, вовлеченных в эндо/экзоцитоз белков, в канцерогенезе. Показана возможность идентифицикации CpG-островков, до сих пор не представленных в опубликованных версиях нуклеотидных последовательностей генома человека, с помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, что позволяет получить информацию о GC-богатых трудноклонируемых районах генома человека.


- 9 -

Метилирование ДНК
Распространение метилирования ДНК.

Метилирование оснований в ДНК было открыто свыше 50 лет назад и наблюдается практически во всех классах живых организмов. ДНК прокариот содержит модифицированные основания ^-метиладенин и 5-метилцитозин, тогда как для эукариот характерно наличие в основном 5-метилцитозина. Он присутствует в ДНК грибов и растений (Finnegan et al. 2000; Martienssen and Colot 2001). В царстве животных наблюдается широкий спектр уровня метилирования генома. На одном из полюсов располагается нематода Caenorhabditis elegans, чей геном лишен 5-метилцитозина и не кодирует соответственно ДНК-метилтрансферазы. Рядом с ней располагается плодовая мушка Drosophila melanogaster. Долгое время считали, что ее геном также не подвергается метилированию. Однако у нее имеется ген, кодирующий белок, гомологичный ДНК-метилтрансферазам млекопитающих (Hung et al. 1999; Tweedie et al. 1999). Недавно было показано, что 5-метилцитозин в ДНК D. melanogaster присутствует в очень малых количествах (Gowher et al. 2000; Lyko et al. 2000). На противоположной стороне от C. elegans находятся позвоночные животные. Их геном имеет самый высокий уровень 5-метилцитозина во всем животном царстве. Метилирование ДНК у позвоночных настолько широко распространено в геноме, что говорят о его тотальном метилировании.

У млекопитающих 5-метилцитозин в геноме встречается практически только в составе CpG динуклеотида. При этом количество CpG динуклеотидов снижено из-за высокой мутабильности 5-метилцитозина, который с высокой вероятностью подвергается спонтанному дезаминированию и превращению в тимин. Это обстоятельство привело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G:C на A:T, в результате чего в геноме млекопитающих динуклеотидов CpG в ~ 5-раз меньше, чем следовало бы ожидать (Gardiner-Gardner and Frommer 1987). У человека

~80% всех CpG динуклеотидов метилировано, и эти метилированные CpG динуклеотиды рассредоточены по геному в виде одиночных сайтов (Bird

1995).

В то же время в геноме позвоночных существуют скопления неметилированных CpG динуклеотидов, именуемых CpG-островками (у человека ~20% от всего числа CpG динуклеотидов). Эти последовательности обладают длиной от 0.5 до 5 т.п.н. (в среднем 1 т.п.н.), встречаются приблизительно один раз на 100 т.п.н., имеют высокую плотность CpG динуклеотидов (близкое к расчетному 1:16), их GC состав превышает 0.55, а отношение экспериментально найденного числа CpG к теоретически возможному составляет не менее 0.6 (Antequera and Bird 1993; Takai and Jones 2002). На основании компьютерного анализа в геноме человека предсказано существование 29 тыс. CpG-островков (Lander et al. 2001; Venter et al. 2001). CpG-островки расположены вблизи генов, преимущественно в 5' области (регуляторные последовательности, промоторы, последовательности первого экзона). Считается, что ~60% человеческих генов содержат CpG-островки (Antequera and Bird 1993). Они имеются, по-видимому, у всех генов, выполняющих базовые клеточные функции (гены "домашнего хозяйства"), и у ~40% генов, выполняющих специализированные функции (тканеспецифические гены). Большинство из CpG-островков остаются неметилированными на всех стадиях развития организма и во всех типах тканей, даже когда ассоциированный с ними ген не функционирует. Например, тканеспецифические гены человека а-глобин (Bird et al. 1987) и а2(1)-коллаген (McKeon et al. 1982) имеют CpG-островки, которые остаются неметилированными во всех протестированных тканях, независимо от статуса экспрессии гена. В то же время в клетке может происходить метилирование CpG-островка, что сопровождается стабильной инактивацией связанного с ним гена. Так, во время развития метилирование CpG-островков наблюдается при установлении геномного импринтинга и инактивации Х хромосомы (см. обзор Bird 2002), а также наблюдается при патологических

процессах, например при канцерогенезе.

Считается, что метилирование CpG-островков в регуляторных областях

приводит к перестройке хроматина в неактивное состояние, что вызывает

инактивацию транскрипции метилированного гена (см. обзор Baylin and Herman 2000; Jaenisch and Bird 2003). Показано, что важную роль в этом играет семейство метил-CpG-связывающих белков, привлекая к

метилированному локусу ДНК гистоновые деацетилазы, которые, в свою очередь, удаляют ацетильные группы у гистонов в составе нуклеосом. Такая

модификация гистоновых белков приводит к превращению открытой, транскрипционно-активной структуры хроматина в закрытую,

транскрипционно-неактивную (рис. 1).

В тоже время транскрипция может регулироваться метилированием одиночных CpG динуклеотидов, расположенных в области промотора в зоне сайта связывания ряда транскрипционных факторов. Метилирование в этом случае имеет относительно локальный характер, препятствуя связыванию чувствительных к метилированию факторов транскрипции, и варьирует в широких пределах в разных тканях. В настоящий момент известно около 20 метилчувствительных транскрипционных факторов. Например, такое сайт-специфическое метилирование и ассоциированная с ним инактивация транскрипции наблюдается в случае с промотором GK-интерферона (Melvin et al. 1995) и участком связывания CREB (cyclic AMP response element-binding protein) промотора гена в-глобина (Iguchi-Ariga et al. 1989). Подобная регуляция может наблюдаться как для генов, обладающих CpG-островками, так и для тканеспецифических генов, их не имеющих. Однако роль метилирования в этом случае ограничивается влиянием на доступность сайта связывания чувствительному к метилированию транскрипционному фактору и реализуется только при наличии в клетке соответствующего белкового фактора.

Функция метилирования ДНК. Наиболее общей функцией метилирования является участие в клеточном "иммунитете". Для бактерий оно характерно как элемент системы метилирования-распознавания "свой-чужой", что дает клетке возможность отличать свой генетический материал от инородных молекул, проникших в клетку. Это позволяет поддерживать генетическую стабильность вида. Иногда один фермент выполняет и метилазную, и эндонуклазную функцию, но в большинстве случаев эти активности разделены между двумя ферментами, один из которых метилирует определенный сайт ДНК, а другой расщепляет. При этом метилазы «метят» специфические последовательности собственной ДНК, а чувствительные к метилированию рестрикционные эндонуклеазы узнают и расщепляют те из последовательностей, которые соответствующей метки не имеют, т.е чужеродную ДНК. Таким способом бактериальная клетка защищается против чужеродной ДНК. Например, последовательность проникшего в бактериальную клетку фага расщепляется в определенных сайтах специфическими эндонуклеазами, в то время как те же последовательности в собственной ДНК клетки защищены от расщепления, так как метилированы (Noyer-Weidner and Trautner 1993).

Роль метилирования ДНК как компонента клеточного "иммунитета", предназначенного для избавления от "ненужной" ДНК (уничтожение или подавления ее функций), сохраняется и у эукариот, но конкретные механизмы реализации этой задачи могут отличаться. Так, в клетках грызунов и человека посредством метилирования происходит стабильное подавление транскрипции интегрированных вирусных последовательностей и транспозонов, что предотвращает их дальнейшие распространение по геному (Barlow 1993; Bestor and Tycko 1996), а у мышей часто происходит инактивация трансгенов (Sasaki et al. 1993). Однако роль метилирования у эукариот не ограничивается защитой клетки от потенциально опасной ДНК. Предполагается, что при усложнении генома в ряду от низших эукариот к высшим происходила функциональная переориентация системы метилирования (Bird 1995). Если у беспозвоночных она в основном сводилась к подавлению активности потенциально опасных последовательностей ДНК (таких как вирусы и транспозоны), то у позвоночных ее назначение - еще и стабильная репрессия эндогенных генов (гены инактивированной Х хромосомы, импринтированные гены). В этом случае метилирование выступает как компенсаторный механизм для организации ДНК сложных геномов в транскрипционно-активные и неактивные области. В связи с этим, наличие метилирования является необходимым условием для процесса регуляции экспрессии генов во время развития и дифференцировки.

Метилирование во время развития Во время нормального развития и клеточной дифференцировки у млекопитающих происходит комплекс изменений в метилировании ДНК


(рис. 2). В зиготе (сразу после оплодотворения) материнские и отцовские хромосомы пространственно обособлены, и их деметилирование происходит



Время развития

Рисунок 2. Схематическое изображение временных изменения в уровне метилирования ДНК в клетках млекопитающих во время развития (по Turker 1999). ППК -примордиальные половые клетки, ЭСК - эмбриональные стволовые клетки.

в разное время (Mayer et al. 2000). При этом отцовские хромосомы деметилируются в течение шести - восьми часов после оплодотворения независимым от репликации путем, тогда как деметилирование материнских хромосом охватывает стадии второго и третьего дробления и происходит в процессе репликации. У мышей в результате этого процесса уровень метилирования генома падает до 30% от наблюдаемого в соматических клетках (Kafri et al. 1992). После имплантации в клетках бластоцисты уровень метилирования восстанавливается, приобретая характерный для клеток взрослого организма паттерн (Turker 1999). Этот процесс начинается метилированием de novo,, затрагивающим специфические последовательности в геноме ("центры метилирования" - транспозоны и повторы). После этого, на втором этапе установления паттерна метилирования, происходит распространение метилирования из центра на окружающие неметилированные сайты. Во время дифференцировки в


клетках значительно снижается способность метилировать ДНК de novo (Turker et al. 1991; Szyf et al. 1990), но сохраняется способность к распространению метилирования из "центров метилирования" (Toth et al. 1989). Однако характерной чертой клеток становится исключительно высокая способность поддерживать установленный статус метилирования в процессе репликации. Этот процесс называется поддерживающим метилированием.

Ферменты метилирования Метилирование остатка цитозина представляет собой перенос метильной группы с молекулы донора на пятый атом углерода в молекуле цитозина ферментативным путем. В клетке наблюдаются два независимых процесса метилирования, осуществляемых, по-видимому, разными ДНК-метилтрансферазами. В первом случае наблюдается приобретение метилированного статуса CpG динуклеотидом, который прежде не был метилирован (реакция метилирования de novo). Во втором, происходит восстановление метилированного состояния CpG динуклеотида из полуметилированного, возникающего в результате полуконсервативной репликации ДНК, т.е. осуществляется передача по наследству характерного статуса метилирования ДНК в ряду клеточных генераций (поддерживающее метилирование).

У млекопитающих наиболее изученным является фермент ДНК(цитозин-5)-метилтрансфераза 1 (Dnmt1), которая в соматических клетках млекопитающих является основным ферментом, имеющим метилтрансферазную активность (Yoder et al. 1997). C-концевой домен Dnmt1 имеет такую же структуру, что и осуществляющие метилирование цитозина ферменты бактерий, которые содержат 10 консервативных мотивов, образующих каталитический центр (Bestor et al. 1988). N-концевой домен представляет собой регуляторную область. Он содержит сигнал ядерной локализации - последовательность, направляющую фермент в локус репликации ДНК (Liu et al. 1998), и район взаимодействия с белком репликации PCNA (Chuang et al. 1997) и фактором регуляции клеточного цикла Rb (Pradhan and Kim 2002). Необходимость Dnmt1 для развития млекопитающих продемонстрирована на мышах. Их эмбриональные стволовые клетки с гомозиготной инактивацией Dnmt1 нормально размножаются, имея сильно деметилированный геном, но погибают при индукции дифференцировки in vitro. Мышиные эмбрионы, несущие дефектную Dnmt1, умирают при имплантации (Li et al. 1992). Показано, что Dnmt1 имеет in vitro высокое сродство к полуметилированной ДНК, как к субстрату для метилирования CpG динуклеотидов. Поэтому считается, что главная ее функция in vivo заключается в осуществлении поддерживающего метилирования, исполнение которого скоординировано в пространстве и времени с процессом репликации. В тоже время Dnmt1 проявляет небольшую способность к метилированию ДНК de novo, которая модулируется как изменениями в N-концевом домене фермента (Bestor 1992), так и вторичной структурой ДНК (Gacy et al. 1995). При этом, вероятно, именно она ответственна за распространение метилирования за пределы центров метилирования, как это показано в прямых тестах с очищенной ДНК (Carotti et al. 1998).

В настоящее время у млекопитающих известно еще три гена, кодирующие белки, аминокислотная последовательность которых также содержит метилтрансферазный домен. Они были обозначены как Dnmt2 (Yoder and Bestor 1998), Dnmt3a и Dnmt3b (Okano et al. 1998). Белок Dnmt2 содержит 6 из 10 консервативных метилтрансферазных мотивов, но лишен большого N-концевого домена. Его мРНК присутствует в малых количествах во всех типах клеток, но, несмотря на наличие метилтрансферазного домена, выявить у Dnmt2 какой-нибудь метилтрансферазной активности на настоящий момент не удалось (Yoder and Bestor 1998).

Dnmt3a и Dnmt3b экспрессируются в больших количествах в эмбриональных стволовых клетках, но в тканях взрослого организма их экспрессия подавлена. Их С-концевой домен аналогичен цитозин­метилирующим ферментам, тогда как последовательность N-концевого отличается от аналогичного домена Dnmt1. Было показано, что обе эти метилтрансферазы обладают одинаковой способностью метилировать полуметилированную и неметилированную ДНК (Okano et al. 1998). Мутация в каталитических центрах Dnmt3a и Dnmt3b лишает эти ферменты способности к de novo метилированию in vivo (см. обзор Hsieh 1999). Инактивация Dnmt3a и Dnmt3b в эмбриональных стволовых клетках показала их необходимость для нормального эмбрионального развития млекопитающих (Okano et al. 1999). В той же работе было продемонстрировано, что эти метилтрансферазы имеют как общие сайты метилирования, так и строго специфичные. Так, Dnmt3b участвует в метилировании минисателлитных повторов центромеры, тогда как Dnmt3a нет.

Исследование уровня мРНК трех человеческих метилтрансфераз DNMT1, DNMT3a и DNMT3b показало, что они проявляют координированный характер экспрессии, как в эмбриональных клетках, так и в тканях взрослого организма (Robertson et al. 1999). По всей видимости, в процессе метилирования ДНК de novo участвуют все три метилтрансферазы, специфически распределяя роли в установлении паттерна метилирования генома. Для установления импринтинга в женских половых клетках показана также необходимость присутствия белка DNMT3L, который не имеет метилтрансферазной активности и колокализуется вместе с DNMT3a и DNMT3b, в то время как за поддержание этого импринтинга ответственна ооцит-специфическая изоформа DNMTlo (Jaenisch and Bird 2003).

Метилирование как динамический процесс Статус метилирования ДНК в любой клетке устанавливается в результате сочетания динамических процессов метилирования и деметилирования. В популяции клеток CpG динуклеотиды могут иметь один из трех профилей метилирования (Turker 1999): полностью метилированные (уровень метилирования почти 100%), неметилированные (около 0%) и частично метилированные (между 0 и 100%), - представляя собой усредненный показатель метилирования, определенный анализом большого числа аллелей. В случае импринтированных генов и генов инактивированной в женских клетках хромосомы Х промежуточный уровень метилирования (около 50%) отражает альтернативное состояние метилирования двух аллелей. Такая наследуемая совокупность всех неметилированных, частично метилированных и полностью метилированных CpG динуклеотидов для данной области ДНК получила название паттерна метилирования. В первых экспериментах, показавших существование воспроизведения статуса метилирования искусственно метилированной ДНК при делении клеток, также наблюдалось относительно низкая точность этого процесса (Wigler et al. 1981). После многих клеточных генераций, исследуемая ДНК сохранила метилирование, но на значительно меньшем уровне, чем это было в начале. Количественные исследования эндогенных CpG динуклеотидов подтвердили относительную стабильность паттерна метилирования (Riggs et al. 1998). Клеточные клоны, в которых изучаемые сайты первоначально были неметелированными, приобретали метилирование, а клоны с метилированными CpG динуклеотидами его теряли. Динамические изменения в деталях статуса метилирования исследовались в области промотора мышиного гена Aprt (Turker 1999). Этот ген обладает CpG-островком, который включает промотор, первый и второй экзоны и первый интрон. Было показано, что статус метилирования CpG динуклеотидов, расположенных в непосредственной близости от начала CpG-островка вне его границ, не однороден в клеточной популяции, тогда как CpG динуклеотиды в составе всех сайтов метилчувствительной рестриктазы HpaII внутри CpG-островка не метилированы. На основании многочисленных экспериментальных данных была предложена модель, объясняющая образование и поддержание паттерна метилирования 5' области гена Aprt (рис. 3). В раннем эмбриогенезе для 5' области гена Aprt характерно неметилированное состояние. Предполагают, что процесс метилирования


начинается после имплантации бластоцисты de novo метилированием в так называемом центре метилирования, активную часть которого составляют две копии B1 элементов, повторяющихся последовательностей грызунов, аналогичных повторам Alu у приматов. Затем метилирование распространяется «ниже» по направлению к промотору гена.



Рисунок 3. Модель возникновения и поддержания паттерна метилирования 5' области гена Aprt мыши. А. На ранних стадиях эмбриогенеза CpG динуклеотиды в составе сайтов рестрикции фермента HpaII (H1-H3) не метилированы. Б. После имплантации происходит de novo метилирование центра метилирования (МС), содержащего В1 повторы и сайт Н1, и распространение метилирования за пределы этой области. В. В некоторых случаях метилирование может распространяться вплоть до сайта Н2, расположенного в непосредственной близости от начала CpG-островка. Г. Наличие сайтов связывания транскрипционного фактора Sp1 препятствует распространению метилирования на область промотора. Такое блокирование метилирования может распространяться от области промотора в сторону центра метилирования и приводить к деметилированию сайта Н2, препятствуя поддерживающему метилированию (по Turker

1999).

Однако, сайты связывания транскрипционного фактора Sp1 предохраняют промотор от экспансии метилирования, блокируя процесс вблизи сайта метилчувствительной рестриктазы ^aII. Как показано, делеции или мутации в сайтах Sp1 приводят к метилированию CpG-островка гена (Macleod et al. 1994; Mummaneni et al. 1995). В силу конкуренции между


импульсами метилирования, исходящими из центра метилирования, и импульсами деметилирования, исходящими из структур промотора, этот сайт находится в динамически изменяющемся состоянии (метилирован менее чем на 50%). Таким образом, в установлении статуса метилирования участвуют два взаимоисключающих друг друга процесса: деметилирование ранее метилированных CpG динуклеотидов и de novo метилирование неметилированных CpG динуклеотидов. И, хотя, по всей видимости, паттерн метилирования ДНК в клетке в процессе развития передается по наследству точно (см. обзор Bird 2002), на уровне одиночных CpG динуклеотидов статус метилирования может варьировать. Поэтому представляется возможным нарушение профиля метилирования при сдвиге равновесия, вызванного усилением или ослаблением одного из двух противоборствующих процессов и развивающегося на протяжении нескольких клеточных поколений. Именно это, по всей видимости, и происходит при старении и злокачественной трансформации клетки.
  1   2   3   4   5   6


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГУ РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
Учебный материал
© nashaucheba.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации