Сорокина И.К. и др. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей - файл n1.doc
приобрестиСорокина И.К. и др. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканейскачать (521.5 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
Культура растительных клеток и тканейУчебное пособие 2002
Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие / Составители: Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А.
Рекомендовано к изданию
УМК биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского;
кафедрой методики преподавания биологии и экологии.
СОДЕРЖАНИЕ:
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Тема 1. Техника культивирования растительного материала на искусственных питательных средах.
Работа 1. Организация биотехнологической лаборатории . . . . . . . . . . .
Работа 2. Приготовление питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro. ..
Работа 3. Способы стерилизации в биотехнологии . . . . . . . . . . . . . . . . .
Работа 4. Способы стерилизации растительных эксплантов. . . . . . . . .
Работа 5. Техника работы в ламинаре при культивировании стерильных проростков. . .
Тема 2. Микроклональное размножение растений и получение безвирусного посадочного материала
Работа 1. Вычленение апикальных меристем и регенерация растений. .
Работа 2. Пролиферация побегов и микрочеренкование стерильных проростков. .
Работа 3. Индукция корнеобразования при микроклональном размножении растений. . .
Работа 4. Получение микроклубней картофеля in vitro. . . . . . . . . . . . . . .
Работа 5. Иммуноферментный анализ. Тестирование растительного материала на содержание вирусов.
Работа 6. Получение безвирусного посадочного материала методом термотерапии в сочетании с культивированием апикальных меристем. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Работа 7. Получение безвирусного посадочного материала методом химиотерапии в сочетании с методом апикальных меристем.
Тема 3. Дедифференциация и каллусогенез в культуре растительных клеток и тканей.
Работа 1. Получение каллусов из листьев табака. . . . . . . . . . . . . . . . .
Работа 2. Получение каллусов из незрелых зародышей и узлов кущения пшеницы. . . .
Работа 3. Получение каллусов из корешков фасоли. . . . . . . . . . . . . . . .
Работа 4. Субкультивирование каллусов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Тема 4. Суспензионные культуры.
Работа 1. Получение и культивирование суспензии. . . . . . . . . . . . . . . . .
Работа 2. Подсчет плотности суспензии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Работа 3. Определение степени агрегированности и жизнеспособности суспензии. . .
Работа 4. Получение клеточных клонов на агаризованных средах. Метод плейтинга. . . .
Тема 5. Гормональная регуляция в культуре клеток и тканей.
Работа 1. Индукция органогенеза и соматического эмбриогенеза в каллусной ткани табака под действием фитогормонов. . . . .
Работа 2. Индукция деления клеток и роста клеток растяжением под действием ауксина и гиббереллина.
Тема 6. Культура гаплоидных клеток.
Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни и яблони. . . . . . . .
Работа 2. Получение растений – регенерантов из пыльцевых каллусов вишни. . .
Терминология. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Приложение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Список литературы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Введение
Современная биотехнология – это наука и отрасль производства, развивающаяся в трех основных направлениях:
– молекулярная биология и генетическая инженерия;
– микробиология и микробиологическая промышленность;
– культура клеток и тканей in vitro.
Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых сортов и видов. Они предлагают принципиально новые пути, такие как сомаклональная изменчивость, мутагенез на клеточном уровне, клеточная селекция, соматическая гибридизация для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании безвирусного материала вегетативно размножаемых растений.
В данном пособии представлены наиболее простые для освоения студентами биологических и сельскохозяйственных специальностей способы культивирования растений in vitro : метод апикальной меристемы; получение каллусов, суспензий и растений – регенерантов как на диплоидном, так и гаплоидном уровне.
По каждой теме предусмотрены: минимум теоретического материала, методика выполнения работы, перечень необходимого оборудования и реактивов. После каждой темы приводятся контрольные вопросы.
Использование данного пособия не исключает подготовку к занятиям по другой учебной литературе.
Тема 1. ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО
МАТЕРИАЛА НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХРабота 1. ОРГАНИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Объяснение. Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы.
Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях должны иметь кафельное покрытие, а потолок должен быть побелен.Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды – до 100–130оС, для инструментов – до 170оС; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4 98 % + K2CrO7).
Оборудование комнаты для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).
Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1–2 атмосферы и температура 120
оС; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.
Оборудование комнаты для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования.
Оборудование культуральных комнат: световое отделение – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25+ – 2оС) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.
Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.
Материалы и оборудование. Химические стаканы (50, 100, 250 мл), штативы с пробирками, инструменты (пинцеты, скальпели, препарировальные иглы), моющие средства (стиральный порошок), хромпик.
Ход работы.
1. Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории.
2. Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава, сушильных шкафов, дистиллятора.
3. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов (стиральный порошок), промыть 8–10 раз проточной водой, поместить на 4–6 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной и бидистиллированной.
4. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при температуре 100–130оС.
5. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, целлофаном.
Работа 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO Объяснение. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.
Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са, Мg. Железо используется в виде хелатов [Fe О 4
? или Fe 2 O 4
? + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.
Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са++, Cl –, Н + не-обходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).
В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20–60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.
Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.
Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы.
Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.
Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).
Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.
Ауксины: ИУК – b-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – a-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота.
Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.
Гиббереллины: гиберрелловая кислота.
В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10–15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.
Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6–6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.
Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5–10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10–40 раз, микросолей – в 100–1000 раз, витаминов – в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5–2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5–1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.
Ход работы.
1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить.
2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.
3. Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.
4. Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5–6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.
5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы.
6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).
7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.
Работа 3. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.
Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5–2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15–20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.
Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1–2 атмосферы и температурой 120оС в течении 20–60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала.
Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы.
Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170–250оС в течении 1–2 часов.
Материалы и оборудование. Чашки Петри, колбы с дистиллированной водой, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и целлофановая.
Ход работы.
1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при to 170–200oС в течение 2 часов.
2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав.
3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течении 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1–0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.
4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1–1,2 атм.
5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.
6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.
Работа 4. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ Объяснение. С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.
Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.
Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Nа, сулемой), бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками.
Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5–7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5–8 минут.
Гипохлорит натрия используется в виде 0,5–5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1–20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2–3 % раствор в течение 10–15 минут, а для сухих семян 3–5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.
Хлорамин применяют в концентрации 1–6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1–3 минут, сухие семена – 30–60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2–3 раза.
Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1–3 минут, для корне- и клубнеплодов – до 10–20 минут.
Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их не-посредственно перед работой.
Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.
Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10–80 мг/л, ампициллин 200–400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.
Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, флаконы со стерилизующими растворами, зерновки пшеницы и тритикале, ламинар-бокс, флакон с 96 % спиртом, вата, спиртовка, пинцеты, фильтровальная бумага.
Ход работы.
1. Отобрать 30 здоровых зерновок пшеницы или тритикале.
2. В ламинар-боксе поместить семена в чашки Петри со стерилизующими растворами по 5 семян в каждую (6 % хлорамин, 6 % гипохлорит кальция, 96 % спирт, сулема 0,1 %, ампициллин 400 мг/л, вода). Время стерилизации подобрать экспериментально.
3. Отмыть семена от стерилизующих растворов дистиллированной автоклавированной водой.
4. Поместить семена для проращивания в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри закрыть и перенести в термостат для проращивания.
5. Результаты опыта зарисовать через неделю. Сделать выводы об эффективности стерилизующих растворов.
Работа 5. ТЕХНИКА РАБОТЫ В ЛАМИНАРЕ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ. Объяснение. Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар-боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмами.
Все поверхности ламинара обрабатываются 96 % спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ-излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатываю 96 % спиртом. Пинцеты, скальпели и препарировальные иглы помещают в стакан с 96 % спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательными средами, стерильные препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, флакон с 96 % спиртом, спиртовка, вата, 6 % раствор хлорамина, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, чашки Петри, зерновки пшеницы.
Ход работы.
1. Отобрать 10 здоровых зерновок пшеницы, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
2. Зерновку поместить на стол ламинара бороздкой вниз.
3. Одной препарировальной иглой придерживать зерновку, другой – надрезать оболочку вокруг зародыша.
4. Боковой частью иглы надавить на зародыш (на границе с эндоспермом) и вычленить его из зерновки.
5. Зародыш поместить в чашку Петри со стерильной дистиллированной водой.
6. Взять из штатива пробирку с питательной средой, обжечь горлышко над спиртовкой, снять пробку. Пробирку держать открытой частью от себя.
7. Препарировальной иглой перенести зародыш на поверхность питательной среды щитком вниз (не заглублять).
8. Пробирку и горлышко пробирки обжечь на пламени спиртовки, пробирку закрыть.
9. Пробирки с зародышами поставить в штатив и перенести на стеллаж в культуральную комнату.
10. Проростки пшеницы зарисовать через 1–2 недели. Оценить качество посадки.
Контрольные вопросы к теме 1.
1. Как устроена биотехнологическая лаборатория?
2. Как простерилизовать питательные среды, посуду, дистиллированную воду, инструменты, помещение лаборатории?
3. Какие стерилизующие растворы используются для растительных экс-плантов?
4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?
5. Как получают стерильные проростки и для чего их используют?
Тема 2. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ И
ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА.
Работа 1. ВЫЧЛЕНЕНИЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ. Объяснение. В культуре тканей можно размножать растения и получать оздоровленный (безвирусный) посадочный материал. Для оздоровления растений используют культуру апексов или культуру апикальных меристем, так как в стеблевой апекс вирусы проникают медленнее, чем в другие части растений. При культивировании апексов размножение вирусов подавляется реакцией рас-ительного организма на травму, вызванную отсечением верхушки. Обычно на питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм.
В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных растений.
Биотехнология позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур. Наиболее полно разработана технология получения безвирусного картофеля. Система первичного семеноводства и оздоровления посадочного материала картофеля включает следующие этапы: подготовка клубней для вычленения апикальных меристем, вычленение апикальных меристем, регенерация растений из меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте, получение первой продукции безвирусного материала в открытом грунте, выращивание безвирусного посадочного материала в первичных звеньях семеноводства, сохранение коллекции сортов.
В культуре тканей используются апексы верхушечных и боковых почек. Чтобы исключить влияние метаболитов клубня на проростки и повысить регенерационную способность исходного материала из средней части клубня вырезают глазки с частью паренхимы (1,5 ґ 1,5 см). Глазки проращивают на песке, предварительно обработанном сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в темноте при температуре 25 + 2оС, влажности воздуха 70–80 %. Песок дважды в день увлажняют, через 7–10 дней проводят подкормку раствором Кнопа.
Апикальные меристемы проростков изолируют на 12–13 пластохроне*. Изолированные меристемы культивируют в асептических условиях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией цитокининов (6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25 + 2оС, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 кLx и фотопериод 16 часов.
* Пластохрон – промежуток времени между инициациями двух листовых бугорков.
В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 5–6 листочками проходит 30–45 дней, в некоторых случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и проростки периодически пересаживают на новые среды в стерильных условиях.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, флаконы со стерилизующими растворами, (0,2 % диацид или 70 % спирт), чашки Петри, стерильная дистиллированная вода, стерильные инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, скальпели, спиртовка, пробирки со средой.
Ход работы.
1. Поверхность ламинара, штативы, пробирки, микроскоп обработать ультрафиолетом и 96 % спиртом. Руки протереть спиртом. Препарировальные иглы, пинцеты, скальпели поместить в 96 % спирт и перед каждой манипуляцией обжигать на пламени спиртовки.
2. Проростки (2 см) отделить от клубней и поместить в чашки Петри со стерилизующими растворами: в диацид на 3–5 минут, в спирт на 1–2 минуты.
3. Проростки промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой и перенести в стерильные чашки Петри.
4. Тонкой препарировальной иглой у проростков удалить все листья, последовательно обнажая верхушечные и боковые меристемы с примордиями.
5. Меристему с 1–2 примордиями отделить от проростков, при этом величина экспланта должна быть не более 100–250 мкм.
6. Экспланты перенести в пробирку на поверхность питательной среды.
7. Пробирки закрыть пробками, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
8. Результаты зарисовать через 2–4 недели, сделать выводы.
Работа 2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПОБЕГОВ И МИКРОЧЕРЕНКОВАНИЕ
СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ. Объяснение. Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги. Растения, сформировавшие 5–6 листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов.
Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы: при температуре 24–25оС днем и 19–20оС ночью, освещенности 5–6 кLx и продолжительности фотопериода 16 часов.
Рост стебля и корней начинается на 3–4 день после посадки на питательную среду, а полностью растения формируются через 12–15 дней.
Каждое последующее черенкование проводят через 14–20 дней. Из одного растения можно получить 5–8 черенков, а через 2–3 месяца – 3–5 тыс. черенков.
Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам).
Если почки или черенки высадить на питательные среды с высоким содержанием цитокининов, то образуется конгломерат почек и побегов. Полученные побеги легко отделяются друг от друга, их можно либо укоренить, либо использовать для дальнейшего микрочеренкования.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с проростками, пробирки с питательной средой, скальпели, препарировальные иглы, спиртовка, флакон с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. Подготовить ламинар-бокс и инструменты к работе.
2. В ламинаре извлечь стерильные проростки из пробирок.
3. Побеги разделить на микрочеренки (междоузлие с почкой) и посадить в питательную среду на глубину междоузлия.
4. Пробирку закрыть пробкой, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
5. Результаты зарисовать через 2–4 недели. Сделать выводы о степени пролиферации почек различных сельскохозяйственных культур.
Работа 3. ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ
МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ РАСТЕНИЙ. Объяснение. Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их необходимо пересадить на новую питательную среду. Черенки и по-беги легко укореняются на средах с обедненным составом минеральных солей (среда Уайта, Мурасиге-Скуга, разбавленная вдвое), либо на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК.
Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно рассматривать как небольшие укорененные растения, которые необходимо адаптировать к обычным условиям выращивания. Такие растения лучше пересаживать в грунт, когда полностью сформируются 5–6 листьев и достаточно разрастутся корни. Однако, разные виды культурных растений по-разному приспосабливаются к изменению условий среды. Каждое растение требует специально подобранных условий культивирования в грунте, которые устанавливают экспериментально.
Материалы и оборудование. Пробирки с проростками, пробирки с питательными средами для индукции корнеобразования: без гормонов и с добавлением ИУК, стерильные инструменты, ламинар-бокс, спиртовки, флакон с 96 % спиртом, вата, стерильные чашки Петри.
Ход работы.
1. В стерильных условиях проростки извлечь из пробирок и стерильным пинцетом перенести в пробирки с питательными средами для укоренения.
2. Пробирки с пересаженными растениями поставить в штативы и перенести в культуральную комнату с освещением 5 кLx, температурой 25 + 2оС и влажностью воздуха 70 %.
3. Результаты укоренения оценить через 1–4 недели, сделать рисунки.
4. Укоренившиеся растения перенести в ящики или вегетационные сосуды с торфом и песком (3:1).
Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO Объяснение. В практике биотехнологии на искусственных питательных средах с определенным набором биологических регуляторов можно вызвать пролиферацию почек и побегов, укоренить их, а также индуцировать образование микроклубней. Для этого обычно используют среды с высоким содержани-м минеральных солей (Мурасиге-Скуга), углеводов (сахарозы до 8 % от объе-ма среды), цитокининов, абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида.
В течение первых10–12 суток после черенкования растения выращивают на обычном фотопериоде (16–17 часовой) с интенсивностью освещения 3–5 кLx, при температуре 25оС днем и 19–20оС ночью. Последующее культивирование проводят на 12 часовом фотопериоде при той же степени освещенности и температуре. В некоторых случаях, после выращивания в условиях длинного дня пробирки переносят в холодильник с температурой 10оС. образование микро-клубней происходит через 1–1,5 месяца.
Микроклубни хранят в холодильнике при температуре +2 +5оС и влажности воздуха до 95 %. Их закладывают в стерильные пробирки без среды по 10 штук в каждую и закрывают пробками (срок хранения до 6 месяцев). Таким образом, создаются условия, соответствующие периоду покоя картофеля, что способствует лучшей всхожести и жизнеспособности растений.
Весь период от микрочеренкования до получения микроклубней составляет 60–65 дней.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой для получения микроклубней, пробирки со стерильными проростками, имеющими 5–6 сформированных листьев, флаконы с 96 % спиртом для стерилизации инструментов, скальпели, пинцеты, препарировальные иглы, спиртовка, вата, стерильные чашки Петри.
Ход работы.
1. В стерильных условиях, стерильными инструментами извлечь проростки с хорошо сформированными корнями из пробирок и перенести на питательные среды для индукции клубнеобразования.
2. Пробирки с пересаженными в них растениями закрыть и перенести в культуральную комнату.
3. Провести наблюдение процесса клубнеобразования через 4–6-8 недель культивирования.
4. Результаты зарисовать, сделать выводы на основании теории гормональной регуляции.
5. Заложить микроклубни на хранение.
Работа 5. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ТЕСТИРОВАНИЕ
РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА НА СОДЕРЖАНИЕ ВИРУСОВОбъяснение. Принцип метода ИФА заключается в следующем: к одному из компонентов антиген-антитело присоединяют фермент, другой компонент сорбируют на твердой фазе. Затем проводят реакцию нейтрализации, добавляют субстрат и определяют активность комплекса. Активность фермента, то есть количество образовавшихся комплексов антиген-антитело пропорционально содержанию вирусов.
Для анализа используют полистероловые плата, в лунки которых добавляют сыворотку и антитела, полученные на основе тестируемых вирусов из крови млекопитающих.
Антитела адсорбируются на поверхности ячеек плата в течение 6 часов. Остатки сыворотки удаляют специальным буфером. Затем в лунки вносят исследуемые вытяжки растений (сок листьев, клубней). При наличии вирусного заражения образуется комплекс вирус-антитело. Обязательно готовят контрольные плата (без заражения). После промывания буфером в ячейки добавляют антитела в комплексе с ферментами: фосфотазой и пероксидазой. В присутствии вируса на поверхности плата образуется комплекс антиген-антитело-фермент. Если материал стерилен, комплексы не образуются, а остатки фермента отмы-ваются буфером. После всех описанных выше манипуляций в лунки плата добавляют субстрат, на котором работает фермент (для фосфотазы необходимы эритроциты крови, которые разрушаются в ее присутствии).
В результате реакции между ферментом и субстратом окраски растворов в лунках плата изменяются в зависимости от степени заражения вирусом: нет окраски – «-» – вирус отсутствует, светло-коричневая окраска – «+» – среднее заражение вирусом, ярко-коричневая окраска –«++» – высокая степень заражения вирусом.
Для успешного тестирования вирусов необходимо создать стандартные условия, использовать высококачественные антитела, ферменты, плата.
Материалы и оборудование. Полистероловые плата, растительные вытяжки, гомогенизатор, сыворотки, растворы ферментов, кровь млекопитающих, буферный раствор, центрифуга, растительный материал.
Ход работы.
1. Растительный материал гомогенизируют и центрифугируют.
2. Заполнить сывороткой полистероловые плата и оставить для инкубации на 6 часов.
3. Промыть плата буфером.
4. Внести в лунки плата центрифугат и оставить для инкубации на 1 час.
5. Промыть плата буфером.
6. Заполнить плата сывороткой с ферментом и оставить на 1 час.
7. Промыть плата буфером.
8. Внести в лунки субстрат для фермента.
9. Протестировать изменение окраски в лунках плата по шкале.
10. Отобрать образцы без вирусов, со слабой степенью заражения и с сильным заражением вирусом.
11. Результаты тестирования зарисовать, сделать выводы о качестве посадочного материала.
Работа 6. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ТЕРМОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Объяснение. В случае заражения посадочного материала вирусами применяют термотерапию. Предварительно клубни без бактериальных и грибковых инфекций тестируют ИФА. Затем их размещают в кюветах со стерильным пес-ком и проращивают 1–2 недели при температуре 28–30оС, 4 недели при температуре 37–38
оС и влажности воздуха 70–80 %. Дважды в день песок увлажняют, через 7–10 дней проводят подкормку раствором Кнопа и микроэлементов по прописи Мурасиге-Скуга: 5 мл маточного раствора на 1 л раствора Кнопа. Клубни жаровыносливых сортов можно сразу выращивать при температуре 37–38оС и влажности воздуха 70 %.
Режим тепловой обработки для каждого сорта подбирают экспериментально.
В случаях заражения растений мозаичными, веретеновидными, нитевидными, палочковидными вирусами термическая обработка малоэффективна. По-этому дополнительно используют биотехнологические методы: метод апикальных меристем. Для этого перед термообработкой верхушки растений картофеля срезают и помещают на 5 часов в раствор гетероауксина (50 мг/л). Укорененные проростки помещают в культуральные камеры или комнату с температурой воздуха 37оС, почвы – 30–32оС, с фотопериодом 16 часов на 4–6 недель.
Термообработку обычно проводят осенью и зимой. Весной из растений вычленяют пазушные почки от 0,3 до 1 мм и высаживают на питательные среды (МС без гормонов, pH 5,7).
Материалы и оборудование. Клубни картофеля, кюветы с песком, флаконы с водой, кюветы с проращенными и прошедшими термотерапию растениями, ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, стерильные скальпели, препарировальные иглы, флаконы с 96 % спиртом, хлорамином, спиртовки, пробирки с питательными средами.
Ход работы.
1. Здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной водой.
2. Клубни обработать стерилизующим раствором (спирт, хлорамин), промыть проавтоклавированной водой.
3. Вырезать глазки с частью паренхимы (1,5 ґ 1,5 см) и поместить в кюветы для проращивания и термотерапии.
4. Проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.
5. В ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить их в пробирки с питательными средами.
6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.
7. Результаты зарисовать через 2–4-6–8 недель.
Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ
АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ. Объяснение. Для химиотерапии используют специальные вещества-ингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к большому расходу вещества. Поэтому эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для культивирования апексов.
РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на 10–35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30–40 % больше образуется растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинар-бокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 % спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н), химическая посуда (колбы на 50–100 мл, стаканы на 50–100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.
Ход работы.
1. Раствор РНК-азы профильтровать через фильтр Зейтца, добавить в 100 мл среды Мурасиге-Скуга и разлить в пробирки с застывшей стерильной средой до 0,5 см.
2. Простерилизовать проростки картофеля в 6 % хлорамине 5 минут.
3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в стерильные чашки Петри.
4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).
5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.
6. Результаты зарисовать через 2–4-6 недель, сделать выводы.
Контрольные вопросы к теме 2.
1. Что такое микроклональное размножение растений: основные этапы?
2. Каковы основные способы микроклонального размножения?
3. Как получить безвирусный посадочный материал?
4. Какой из способов получения безвирусного посадочного материала Вы бы предпочли в своей работе?
5. Чем отличаются питательные среды для пролиферации побегов, индук-ции корнеобразования, культивирования меристем, получения микроклубней?
6. Как протестировать посадочный материал на степень заражения вируса-ми?
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ