Лабораторная работа - Биохимия крови - файл n1.doc

Лабораторная работа - Биохимия крови
скачать (457.5 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc458kb.29.05.2012 23:52скачать

n1.doc

  1   2   3
Вологодская государственная молочно хозяйственная академия

им. Н.В. Верещагина.
Технологический факультет
Кафедра биологической и органической химии

Лабораторная работа по биохимии
Тема «Биохимия крови»

Выполнила: студ. 131/1 гр. Бурыкина Т.П.

Проверила: ст. преп. Лупандина А.С.

Вологда-Молочное

2003 г.

2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

2. 1.1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Метод рефрактометрии основан на определении показателя преломления (числа рефракции).

Показатель преломления зависит от концентрации раствора, а также от температуры и длины волны света

Каждое вещество в смеси обладает показателем преломления, представляющим сумму показателей преломления всех входящих в смесь веществ. Так, показатель преломления сыворотки крови состоит из показателей преломления белков, минеральных ве­ществ, воды, холестерина, липидов и других. А так как концент­рация белков в сыворотке крови превалирует над концентрацией других составных частей сыворотки, то последними можно пренебречь, и по показателю преломления сыворотки можно косвенно судить о концентрации белков в ней.

Устройство рефрактометров основано на явлении полного внутреннего отражения, происходящего на границе раздела двух сред, одна из которых является более плотной. Рефрактометры имеют две призмы - измерительную и осветительную. Постоянную температуру прибора поддерживают, пропуская воду с температу­рой 20°С с помощью ультратермостата, который соединяют с реф­рактометром. Длина волны соответствует источнику света, кото­рый используется для данного рефрактометра; это может быть од­нородный свет натриевого пламени, естественный дневной и свет электролампы (75-100 Вт). При естественном освещении и свете электролампы следствие рассеивания лучей света граница свето­тени получается радужная, расплывчатая. Для устранения этого явления служит компенсатор дисперсии.

2. 1.2. ХОД РАБОТЫ

Используют универсальные рефрактометры марок ИРФ-454,
РЛ-2 и РЛ-3.

Перед началом работы производят настройку прибора. Для этого на нижнюю (измерительную) призму наносят стеклянной па­лочкой несколько капель дистиллированной воды, не касаясь по­верхности призмы во избежание царапин. Верхнюю (осветительную) призму осторожно опускают на нижнюю. Камеру призм соединяют штуцерами с ультратермостатом и пропускают воду с температурой 20°С в течение 10-15 минут. Затем луч света (естественного или от электролампы) направляют в окно осветительной призмы с по­мощью зеркала, находящегося под камерой призм. Устанавливают окуляр на резкость, вращая его вдоль оси. В окуляре наблюдают поле светотени (вверху - светлое, внизу - темное), визирные линии и шкалу показателя преломления. С помощью дисперсионного винта устраняют радужную границу, а с помощью регулировочного винта совмещают границу светотени с точкой пересечения визир­ных линий. Затем снимают показания со шкалы показателя прелом­ления. Освещение шкалы производят отражением луча света от бо­кового зеркала.

При правильной установке прибора показатель преломления дистиллированной воды соответствует 1,3328. Если совпадения не происходит, то его добиваются при помощи специального ключа.

Призмы насухо вытирают мягкой тканью. На нижнюю наносят 2-3 капли сыворотки крови. Быстро закрывают верхнюю призму и повторяют всю процедуру измерения. А именно, наблюдая в оку­ляр, устраняют радужную границу, совмещают границу светотени с точкой пересечения визирных линий и снимают показания со шкалы коэффициента преломления.

Измерения повторяют 3-5 раз и берут среднее арифмети­ческое.
РАСЧЕТ

Среднее значение показателя (коэффициента) преломления переводят в массовую долю белка в процентах, пользуясь таблицей Приложения 1.
2.2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ПО РАЕВСКОМУ

2.2.1.КРАТКАЯ ТЕОРИЯ К РАБОТЕ

Все биохимические процессы в живом организме могут проте­кать только при строго определенной концентрации водородных ионов, т.е. при определенной рН среды. Так, допустимые физио­логические колебания рН крови должны лежать в пределах 0,05 --0,1 единицы. Смещение рН крови на 0, 5 единицы приводит к аго­нии. Постоянство рН среды обеспечивается буферными системами.

Буферность - это явление, при котором устойчиво сохраня­ется рН среды в определенных границах при добавлении небольших количеств кислот или щелочей. Иначе говоря, буферность - это кислотно-щелочное равновесие, обеспечивающее постоянство рН жидких сред организма.

Свойствами буферных систем обладают смеси слабых кислот или слабых оснований с их солями.

Каждая буферная система имеет определенную силу, или бу­ферную емкость. Это количество кислоты, которое необходимо до­бавить к буферной смеси, чтобы изменить рН на единицу. Так, буферная емкость крови настолько велика, что для смещения рН крови на единицу надо добавить кислоты в 320 раз больше, чем к такому же количеству воды.

В живых организмах есть несколько буферных систем, кото­рые обеспечивают постоянство рН внутри клеток и во внеклеточ­ных жидкостях.

В крови различают плазменные и клеточные (эритроцитарные) буферные системы.

К плазменным буферным системам относятся три: гидрокарбо­натная, фосфатная и белковая; к клеточным - эритроцитарная, т.е. гемоглобиновая. Одна из главных плазменных буферных сис­тем - гидрокарбонатная. Она состоит из угольной кислоты, явля­ющейся донором протонов, и ее натриевой соли, выполняющей функцию акцептора протонов. Физиологическое значение рН крови устанавливается при соотношении компонентов этой пары, равном 1:20. Именно в таком соотношении и находятся компоненты гидро­карбонатного буфера в крови :

Н2С03 : НС03- = 1:20

Образующиеся и поступающие в кровь кислоты связываются анионом, образуя слабо диссоциирующую угольную кислоту. В лег­ких угольная кислота разлагается на воду и двуокись углерода, который удаляется из легких с выдыхаемым воздухом:

НС03- + Н+ = Н2С03 = Н20 + CO2

Второй компонент гидрокарбонатной буферной системы угольная кислота - нейтрализует попадающие в кровь анионы гидрокси-групп:

Н2С03 + ОН- = Н20+ НС03-

В результате этого рН крови не изменяется ни в том, ни в другом случае.

Следовательно, для поддержания постоянства рН крови необ­ходим определенный запас гидрокарбонатов и других щелочнореагирующих веществ, что называется резервной щелочностью крови.

Резервная щелочность (РИ|) крови выражается количеством миллилитров выделяющейся двуокиси углерода на 100 см3 плазмы (объемные проценты), а также может выражаться кислотной ем­костью, т. е. количеством миллиграммов щелочи, идущей на нейтрализацию избытка кислоты, которую добавляют к крови. В пос­леднем случае расчет ведут на 100 см3 крови и поэтому кислот­ная емкость выражается в мг% щелочи.

Определение РЩ имеет диагностическое значение, так как этот показатель может изменяться при многих патологических состояниях животного. В норме после тяжелой работы РЩ умень­шается до 50%, но быстро восстанавливается при покое.

Понижение РЩ называется ацидозом, что наблюдается при кетозах, в период лактации у самок, при сердечной недостаточ­ности, нарушении функции легких, при рахите и др. При этом в крови накапливается столько кислот, что они не могут быть нейтрализованы буферными системами, и рН крови сдвигается в кислую сторону.

Повышение РЩ называется алколозом. При этом происходит накопление гидрокарбонатов в крови, избыток которых выделяется с мочой. Алколоз развивается при сильной рвоте, гипервентиля­ции легких, при отравлении угарным газом, при некоторых инфек­ционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой и др.

В Приложении 2 приводится таблица рН и РЩ крови некоторых видов животных в норме.
2.2.2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Методом по Раевскому определяют резервную щелочность кро­ви, выраженную в единицах кислотной емкости, т. е. количеством соляной кислоты, затраченной на выделение угольной кислоты из гидрокарбоната натрия, содержащегося в 100 см3 крови:

НС1 + NаНС03 = Н2С03 + NaCl

2. 2. 3. ХОД РАБОТЫ

Берут две пробирки - контрольную и рабочую. В контрольную пробирку вносят 2 см3 4%-ного раствора хлорида натрия, добавляют 1-2 капли 1%-ного водного раствора индикатора ализаринового красного и по каплям 0,01 моль/дм раствора соляной кислоты до появления желтого окрашивания. Это эталонная окраска.


В рабочую пробирку вносят 2 см3 0, 4%-ного раствора хлори­да натрия для стабилизации белков, добавляют 0,2 см3 сыворотки крови, 1-2 капли 1%-ного раствора ализаринового красного, и все перемешивают. Полученную смесь титруют из микробюретки 0,01 моль/дм3 раствором соляной кислоты до перехода вишне­во-красной окраски в желтую, соответствующую окраске в конт­рольной пробирке.
2.2. 4. РАСЧЕТ

РЩ вычисляют по формуле:

(мг%)

где: X -резервная щелочность крови в мг% щелочи (гидроксида натрия);

V -объем 0,01 моль/дм3 раствора соляной кислоты, пошед­шей на титрование рабочей пробы, см3;

0,4 - мг NaOH, соответствующее 1 см3 точно 0,01 моль/дм3 раствора соляной кислоты; 0.2 -количество сыворотки, взятое для исследования, см .
  1   2   3


Учебный материал
© nashaucheba.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации