Лабораторный практикум по микробиологии - файл n1.doc

Лабораторный практикум по микробиологии
скачать (436 kb.)
Доступные файлы (1):
n1.doc436kb.01.06.2012 11:13скачать

n1.doc

  1   2   3   4
ЗАНЯТИЕ № 1

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МЕТОДЫ ИХ СТЕРИЛИЗАЦИИ

ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель: Изучить правила работы в микробиологической лаборатории, особенности культивирования микроорганизмов, способы приготовления питательных сред и методы их стерилизации.

Задачи

  1. Ознакомится с правилами поведения при выполнении микробиологического практикума.

  2. Изучить особенности культивирования микроорганизмов.

  3. Изучить методы приготовления и разлива питательных сред.

  4. Изучить методы стерилизации посуды и питательных сред.

  5. Приготовить и разлить питательную среду МПА.

  6. Получить накопительную культуру сенной и картофельной палочек.

Литература

  1. Аникеев В.В., Лукомская К.А. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.:Просвещение, – 1983.

  2. Гусев М.В. Микробиология: учебник для вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. – Москва, 2004

  3. Емцев В.Т. Микробиология: учебник для вузов / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М.: Дрофа, 2005.

  4. Лукомская К.А. Микробиология с основами вирусологии. М.:Просвещение, - 1983.

  5. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. / Под. Редакцией Воробьева А.А. и Кривошеина Ю.С. - М.:Мастерство, 2001.

  6. Пименова М.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Москва, 1971.

  7. Практикум по микробиологии. Под ред. Нетрусова А.И. – М.: Академия, - 2005.

  8. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии. – М.: Дрофа, 2004.

Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, стерильные конические колбы на 100-150 мл, агар питательный, пептон, сено, клубни картофеля, мел, плитка, спиртовки, колбы, вата, марля, пипетки, весы, разновесы, термостат.

Основные понятия. Культивирование, культура, поверхностное культивирование, глубинное культивирование, периодическое культивирование, непрерывное культивирование, чистая культура, накопительная культура, посев, инкубация, пассирование, элективные среды, накопительные среды, оптимальные среды, естественные среды, синтетические среды, полусинтетические среды, агар, стерилизация, фламбирование, тиндализация, пастеризация, автоклавирование, МПА.

Ход работы


Задание № 1. Изучить правила работы при выполнении микробиологического практикума.

Задание № 2. Изучить классификацию питательных сред, особенности их приготовления и разлива, методы стерилизации питательных сред и посуды.

Задание № 3. Приготовить и разлить питательную среду МПА в стерильные чашки Петри.

Задание № 4. Получить накопительную культуру сенной палочки (Bacillus subtilis).

Сено мелко на­резают и помещают в колбу объемом 500 мл, заполняя ее на одну четверть объема, добавляют щепотку мела и кипятят 15-20 мин, пока среда не приобретет цвет настоя крепкого чая. Сенной отвар разливают в стерильные конические кол­бы на 100-150 мл слоем 1,0-1,5 см, закрывают ватными пробками и поме­щают в термостат при температуре 22-25 °С.

Через двое суток на поверхности среды развивается бело­ватая пленка Вас. subtilis, которая при старении, на 3-4-е сут­ки, становится серовато-зеленоватой. Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в небольших количествах.

Задание № 5. Получить накопительную культуру картофельной палочки (Вас. subtilis var. mesentericus).

Промытые клубни картофеля, не очищая, нарезают кружоч­ками. Поверхность их натирают мелом для нейтрализации среды и помещают в стерильные чашки Петри на двойной слой фильтроваль­ной бумаги, смоченный дистиллированной водой. Чашки с кар­тофельной средой выдерживают в автоклаве при 0,5 атм в тече­ние 10 мин и ставят в термостат с температурой 27-30°С на 3-4 суток.

На поверхности ломтиков картофеля образуется плотная морщинистая пленка культуры картофельной палочки. Окраска пленки может быть разной: беловато-серой, розоватой, желто-бурой, черной, что зависит от разновидностей культуры, полу­чивших преимущественное развитие.

Контрольные вопросы

  1. Классификация питательных сред.

  2. Методы стерилизация лабораторной посуды и питательных сред.

  3. Методы приготовления отдельных питательных сред (МПБ, МПА, МПЖ, СА, КА и др.) Разливка питательных сред.

  4. Особенности культивирования микроорганизмов (поверхностное и глубинное, периодическое и непрерывное). Накопительные и чистые культуры.

Вопросы для самостоятельного изучения

    1. Способы приготовления нативных и фиксированных препаратов микроорганизмов.

    2. Изучить основные этапы развития науки микробиологии, вклад русских и зарубежных ученых в ее развитие. Заполнить таблицу № 1.

Таблица № 1. История развития микробиологии

Дата

Ученый, название трудов

Направление исследования




А. ван Левенгук, Л. Пастер, Р. Кох, Л.С. Ценковский, И.И. Мечников, Н.Ф. Гамалея, Э. Дженнер, М. Бейеринк, С.Н. Виноградский, Д.И. Ивановский, Г.Н. Минх, В.Л. Омелянский, А. Клюйвер, К.ван Ниль и др.





ЗАНЯТИЕ № 2

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИВЫХ И ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЗНАКОМСТВО С ИХ МОРФОЛОГИЕЙ

Цель: Изучить методы и приемы приготовления микропрепаратов при исследовании микроорганизмов и познакомится с их морфологией.

Задачи:

  1. Изучить особенности морфологии бактериальных клеток.

  2. Приготовить прижизненный и фиксированный микропрепараты микроорганизмов.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, бактериологическая пет­ля, спиртовка, фильтровальная бумага, кристаллиза­тор с мостиком для препаратов, промывалка с водой, водные растворы красителей – фуксина, метиленового синего, генцианвиолета (далее – оборудование для приготовления микропрепаратов); иммерсионное масло, микроскоп; мясная вода, дрожжи, культуры сенной и картофельной палочки.

Ход работы

Задание № 1. Провести прижизненное изучение бактериальных клеток следующими методами, сделать рисунки:


Метод раздавленной капли. На предметное стекло микробиологической петлей наносят каплю одной из жидкостей. Покровное стекло ставят на ребро у края капли и постепен­но опускают на нее.

Метод висячей капли. По центру покровного стекла наносят бактериологической петлей небольшую каплю исследуемой жидкости и опрокидыва­ют его над углублением специального предметного стекла.

Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, что поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло.

Задание № 2. Приготовить фиксированный препарат Вас. subtilis, Вас. subtilis var mesentericus, St. lactis, S. cerevisiae, E.coli (рис. № 1, 2, 3, 4 приложения), сделать рисунки.


    1. Нанесение. Предметное стекло обсушивают на пламени спиртовки. Бактерио­логической петлей, простерилизованной на пламени горелки, по центру предметного стекла наносят мазок исследуемого мате­риала. Если культура микроорганизма выращена на плотной питательной среде, предварительно на стекло наносят каплю воды, в нее бактериологической петлей вносят небольшое количество материала и делают мазок.

    2. Высушивание и фиксация. Препарат вы­сушивают на воздухе, а далее фиксируют. Обычные мазки ми­кроорганизмов фиксируют термически, проводя стекло 2—3 ра­за через пламя горелки мазком вверх. Фиксация мазка приводит к гибели микроорганизмов, плот­ному прилипанию их к поверхности стекла и более легкой вос­приимчивости микробов к красителю.

    3. Окраска. Заливают поверхность раствором любого красителя на 2-3 мин (метиленовая синь, генцианвиолет, фуксин). Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

    4. Промывка. Затем краситель с мазка смывают во­дой из промывалки, нижнюю сторону препарата вытирают полоской фильтровальной бумаги, верхнюю осторожно обсушивают и микроскопируют.

Контрольные вопросы и задания

  1. Общая характеристика микроорганизмов. Отличительные признаки прокариот и эукариот.

  2. Форма и размеры бактериальных клеток. Морфологические типы бактерий.

  3. Основы систематики микроорганизмов. Положение бактерий в системе организмов и их изменчивость. Признаки бактерий, используемые при определении вида.

  4. Краткая характеристика порядка Schizomycetales.

  5. Краткая характеристика порядка Actinomycetales. Нокардии. Микобактерии.

  6. Краткая характеристика порядка Myxobacteriales.

  7. Грибы. Краткая характеристика зиго-, аско- и дейтеромицетов.

  8. Заполнить таблицу № 2.

Таблица № 2. Отличительные признаки эукариот и прокариот

Характеристика

Прокариоты

Эукариоты

Цитологические признаки

Наименьший размер клетки — 0,05 мкм







Наличие оформленного ядра







Наличие автономных органелл (митохондрии, хлоропласты)







Рибосомы расположены:

В цитоплазме

На ЭПС







Жгутики (если присутствуют): диаметр 0,01 —0,02 мкм, формула среза 8 + 1

диаметр около 0,2 мкм, формула среза 9 + 2







Молекулярно-биологические признаки

Число хромосом







Кольцевая хромосома







Линейные хромосомы







Константы седиментации рибосом:

70S

80S







Константы седиментации рибосомной РНК

5S 16S 23S

5S 5.85S 18S 28S







Признаки на основе хим. анализа

Присутствие пептидогликана







Питание

Эндоцитоз







Диффиузия или транспорт через мембрану







Размножение

Митоз, мейоз







Перенос генов и рекомбинация включают гаметогенез и образование зигот







Метаболизм

Дыхание и фотосинтез сосредоточены на плазмалемме







Хемолитотрофность, метаногенез, фиксация молекулярного азота, аноксигенный фотосинтез







Вопросы для самостоятельного изучения

  1. Краткая характеристика отельных групп бактерий (по определителю бактерий Берджи).

  2. Морфологическая характеристика и систематика водорослей.

  3. Морфологическая характеристика и систематика простейших.


ЗАНЯТИЕ № 3

ОКРАСКА ВКЛЮЧЕНИЙ, КАПСУЛ И ЭНДОСПОР, ОКРАСКА ПО ГРАМУ

Цель: Изучить методы окраски спор, капсул и включений бактериальной клетки; изучить ее цитологические свойства на примере окраски по Граму.

Задачи:

  1. Обнаружить включения полифосфатов (волютин) в клетках дрожжей.

  2. Обнаружить липидные гранулы в клетках дрожжей.

  3. Обнаружить гликогеноподобные полисахариды в клетках дрожжей.

  4. Обнаружить капсулы бактериальной клетки методом негативного контрастирования (на примере Azotobacter).

  5. Произвести дифференциальную окраску спор и цитоплазмы по методу Ожешки.

  6. Произвести окраску бактерий по Граму.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, бактериологическая пет­ля, спиртовка, фильтровальная бумага, кристаллиза­тор с мостиком для препаратов, промывалка с водой, микроскоп. Водные растворы красителей – фуксина, метиленового синего, генцианвиолета, карболовый фуксин Циля, судан III. Иммерсионное масло, серная кислота 1%, тушь, соляная кислота 0,5%, раствор Люголя. Культуры Вас.subtilis, Вас.mycoides, S.cerevisiae, E.coli.

Основные понятия. Муреин, волютин, нуклеоид, гликоген, капсулы, клеточная стенка, полисахариды, полифосфаты, метахроматические зерна, монотрихи, перетрихи, лофотрихи, бациллярная форма, клостридиальная форма, плектридиальная форма, экзина, интина, метахромозия.

Ход работы

Задание № 1. Обнаружить включения полифосфатов (волютин) в клетках дрожжей. Волютин в клетках грибов и дрожжей локализован в вакуолях, у бактерий и актиномицетов в цитоплазме. Является запасным фосор- и азотсодержащим веществом, производным нуклеиновых кислоты. Характерное свойство – метахромозия, т. е. способность приобретать иной цвет, чем окрашивающие его вещества.

Окраска волютина по методу Омелянского. На предметном стекле готовят тонкий мазок из культуры микроорганизма, высушивают на воздухе, фиксируют на пламени, окрашивают карболовым фуксином 30-40 с и промывают водой. Дифференцируют, погружая его в склянку с 1%-ным раствором серной кислоты на 20-30 с и немедленно промывают водой. Серная кислота обесцвечивает цитоплазму, а зерна волютина остаются окра­шенными фуксином. Препарат докрашивают метиленовым си­ним (1:40) 20-30 с, промывают водой, высушивают на воз­духе и микроскопируют. На пре­парате зерна волютина окрашены в красный цвет, цитоплазма клетки – в голубой (рис. № 1, 2 приложения).

Задание № 2. Обнаружить липидные гранулы в клетках дрожжей. Резервные липиды у дрожжей и мицелиальных грибов представлены нейтральным жирами; у бактерий эту функцию выполняет оксимасляная кислота.
  1   2   3   4


ЗАНЯТИЕ № 1 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МЕТОДЫ ИХ СТЕРИЛИЗАЦИИ
Учебный материал
© nashaucheba.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации